PO.CL05.02 · 临床研究
用于快速、当日免疫细胞疗法的非病毒 mRNA 工程平台
A non-viral mRNA engineering platform for rapid, same-day immune-cell therapies
作者与单位 Authors & Affiliations
摘要 Abstract
中文摘要
背景：细胞免疫疗法已经改变了癌症治疗，但在实体瘤中的成功仍受限于漫长的制造时间、高昂的成本，以及对永久性修改 DNA 的病毒载体的需求。为解决这一问题，我们研究了电穿孔（EP）和机械穿孔（MP）方法，用 mRNA 转染 T 细胞，以实现床旁免疫细胞编辑平台的开发。NKG7，即自然杀伤细胞颗粒-7，此前已被证明在激活 T 细胞细胞毒性功能中发挥关键作用。用 NKG7 进行 T 细胞的 mRNA 转染可增强这些细胞的抗肿瘤细胞杀伤能力。我们在来自健康供体的原代外周血单个核细胞（PBMC）中考察了 EP 和 MP 方法用于 NKG7 转染。
方法：将编码 NKG7 或 NKG7 与膜结合型 cRNA IL-2 的合成 Clean Cap mRNA 通过电穿孔（MaxCyte）或机械穿孔（Portal Bio）导入 PBMC。通过 CytoFlex 流式细胞术和 Kaluza 分析 T 细胞的 NKG7 和 IL-2 表达。
结果：EP 和 MP 的产率相当，分别为 0.615±0.09% 和 0.597±0.16%。EP 和 MP 后 3 天内活力较高，均在 80% 以上。NKG7 和 NKG7+cIL-2 mRNA 转染导致 T 细胞中不同的 NKG7 表达动力学，且 EP 与 MP 之间存在差异。采用 EP 时，CD4 T 细胞的 NKG7 表达增加，与模拟 EP 相比，仅 NKG7 EP 在第 1 天具有最高的 MFI 比值（NKG7 MFI/IgG MFI）（1.25 ± 0.38），NKG7+cIL-2 EP 在第 2 天最高（1.20 ± 0.27）。CD8⁺ T 细胞显示出类似趋势，NKG7 EP 在第 1 天 NKG7 表达达到峰值（1.22 ± 0.76），NKG7+cIL-2 EP 在第 2 天达到峰值（1.21 ± 0.90）。然而，MP 未增强 CD4⁺ T 细胞中的 NKG7 表达。NKG7 和 NKG7 + cIL-2 的 NKG7 表达均在第 1 天达到峰值（分别为 1.28 ± 0.42 和 1.24 ± 0.20）。IL2 表达在 EP 和 MP 中均在第 1 天达到峰值：EP，CD4⁺ T（91.5% ± 4.4）、CD8⁺ T（92.7% ± 12.8）；MP，CD4⁺ T（88.9% ± 31.7）、CD8⁺ T（84.7% ± 9.6）。这些转染细胞抗肿瘤细胞杀伤的功能检测目前正在进行中。
结论：我们报告 PBMC 的 EP 可转染所有细胞群。与 EP 相比，MP 可能在 CD8 T 细胞中产生相当的产率、活力和 NKG7 表达，但无需从 PBMC 中分离 CD8 T 细胞。EP 和 MP 方法可根据感兴趣的靶标和细胞群用于床旁免疫细胞转染。
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Background: Cellular immunotherapy has transformed cancer treatment, but success in solid tumors remains limited by long manufacturing times, high costs, and the need for viral vectors that permanently modify DNA. To address this, we examined electroporation (EP) and mechanoporation (MP) approach to transfect T cells with mRNA to enable the development of a bedside immune cell editing platform. NKG7, natural killer cell granule-7, was previously demonstrated to play key function in activating T-cell cytotoxicity function. mRNA transfection of T cells with NKG-7 can increase these cells' anti-tumor cell killing. We examine EP and MP methods for NKG7 transfection in primary peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from healthy donors.
Method: Synthetic Clean Cap mRNAs encoding NKG7 or NKG7 with membrane-bound cRNA IL-2 were introduced into PBMCs by electroporation (MaxCyte) or mechanoporation (Portal Bio). T cell expression of NKG7 and IL-2 were analyzed by CytoFlex flow and Kaluza.
Result: The yield at EP and MP were comparable at 0.615+/-0.09% and 0.597+/-0.16%, respectively. Viability were high at above 80% for 3 days after EP and MP. NKG7 and NKG7+cIL-2 mRNA transfection led to different NKG7 expression kinetics in T-cells and between EP and MP. With EP, CD4 T-cells showed an increase in NKG7 expressions with the highest MFI ratio (NKG7 MFI/ IgG MFI) compared to mock EP at Day 1 for the NKG7 -only EP (1.25 ± 0.38) and at Day 2 for NKG7+cIL-2 EP (1.20 ± 0.27). CD8⁺ T cells displayed a similar trend, with peak NKG7 expression at Day 1 for NKG7 EP (1.22 ± 0.76) and Day 2 for NKG7+cIL-2 EP (1.21 ± 0.90). However, MP did not enhance NKG7 expression in CD4⁺ T cells. NKG7 expression peaked at Day 1 for both NKG7 (1.28 ± 0.42) and NKG7 + cIL-2 (1.24 ± 0.20). IL2 expression peaked at Day 1 for both EP and MP: EP, CD4⁺ T (91.5% ± 4.4), CD8⁺ T (92.7% ± 12.8); MP, CD4⁺ T (88.9% ± 31.7), CD8⁺ T (84.7% ± 9.6). Functional assays for anti-tumor cell killing of these transfected cells are currently ongoing.
Conclusions: We report that EP of PBMC can transfect all cell populations. MP may yield comparable yield, viability and NKG7 expression in CD8 T cells compared to EP, but without the need to isolate CD8 T cells from PBMC. EP and MP method can be used for bedside immune cell transfection depending on the target and cell populations of interest.
利益披露 Disclosure
C. Wu, None..
V. Van Keulen, None..
T. Peikert, None.